吴维海  牛景月  夏素萍  刘清池  武大勇  冯新旺

石家庄平安医院   石家庄  050021

 

摘要  目的 探讨二号再生胶囊治疗特发性血小板减少性紫癜（ITP）的疗效。方法 用免疫法建立小鼠ITP模型，设正常对照组、豚鼠血清对照组、模型组、阳性药组、低剂量实验组和高剂量实验组共6组，实验组和阳性药组灌胃给予不同剂量的药物，其它各组给予等量生理盐水。实验过程中观察小鼠一般情况的改变。给药10天后处死小鼠，检测小鼠体重、脾脏和胸腺指数、血像、骨髓像、脾脏病理和T淋巴细胞亚群等各项指标的改变。结果 模型组小鼠出现紫癜和胃肠道出血症状，血小板显著降低，与其它各组相比有显著性差异（P<0.01）,并有骨髓巨核细胞数增多，表现出骨髓细胞成熟障碍。实验组和阳性药组对ITP小鼠有明显的治疗作用，表现为血小板明显增多，与模型组相比差异显著（P<0.01）, 骨髓细胞成熟障碍减轻，巨核细胞数恢复正常，尤其以产板巨核细胞显著增多（P<0.01）,脾脏指数降低，外周血CD8降低，CD4/CD8比值升高。各实验组中以高剂量实验组效果最为明显。结论 二号再生胶囊治疗特发性血小板减少性紫癜模型小鼠疗效显著，尤其以升高血小板的作用最为明显。其作用机制与调节机体的免疫功能有关。

关键词  中药；复方；特发性血小板减少性紫癜；治疗；实验研究

Experimental study of idiopathic thrombocytopenic purpura treated by No. 2 Zaisheng capsule   Shjiazhuang Pingan Hospital,Shijiazhuang 050021

Abstract Objective To investigate the therapeutic effect of No.2 Zaisheng capsule on idiopathic thrombocytopenic purpura in mice. Methods The ITP model in mice was made by immunological method. 60 mice were randomly divided into 6 groups,control group,serum control group,model group,positive drug group,low-dose experimental group and high-dose experimental group,10 mice in each group.The mice in experimental group and positive drug group were given different dose drugs by gavage,however,the mice in the rest groups were given normal saline instead.The general condition of mice during experiment was observed. The mice were killed after 10 days and the mice’s body weight, spleen and thymus index, hemogram, myelogram, pathological changes of spleen,T lymphocyte subpopulation were detected. Results The purpura and gastrointestinal hemorrhage were found in mice of model group, and platelet was significantly decreased, as compared with that of the other groups (P<0.01). The increase of  bone  marrow  megakaryocyte and dysmaturity  of marrow cells were found in model group. The experimental group and positive drug group had obvious therapeutic effect,which could increase platelet significantly,as compared with model group(P<0.01).The drugs could relieve obviously dysmaturity of marrow cells,decrease the numbers of bone marrow megakaryocyte,increase significantly the numbers of platelet-produced megakaryocyte (P<0.01),decrease spleen index, reduce the numbers of CD8,as a result,increase the ratio of CD4/CD8. The therapeutic effect was most remarkable in high-dose experimental group. Conclusion No.2 Zaisheng capsule has obvious therapeutic effect on idiopathic thrombocytopenic purpura in mice, which can significantly increase platelet, and its mechanism of action is related to the regulation of immunological function.

 

Key words  TCM; Complex prescription; Idiopathic thrombocytopenic purpura; Treatment; Experimental study    

    特发性血小板减少性紫癜（ITP）是以出血及外周血小板减少，骨髓巨核细胞数正常或增多伴有成熟障碍为主要表现的常见出血性疾病，为自身免疫病，属中医血证、发斑等范畴。目前对本病尚无有效的治疗措施^[1,2]。二号再生胶囊为丹皮、生地、三七、太子参等组成的复方中药制剂，有扶正固本、活血止血、凉血解毒之功效。临床治疗慢性ITP取得了满意的疗效，为了进一步探讨该复方中药抗血小板减少的作用机制，本实验以免疫法建立ITP动物模型，观察中药二号再生胶囊治疗特发性血小板减少性紫癜的疗效并探讨其作用机理，为临床治疗ITP提供实验依据。

1.1  材料

1.1.1实验动物 BALB/c小鼠由中国医学科学院实验动物研究所提供，二级动物，合格证号：SCXK京 2000-0006。雌雄各半，体重22±2克，共120只，其中60只为建立ITP模型使用。豚鼠 10只，体重400克±20克，由河北医科大学实验动物学部提供。

1.1.2 实验药物  二号再生胶囊由平安医院提供，规格：0.35g×100粒。批号：20040318。阳性对照药：血康口服液，由江西天狮中药集团有限责任公司贵溪制药厂制造，批号：20030115。生理盐水由石家庄第四制药厂制造，批号：20030815。弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，Sigma产品。

1.1.3实验仪器 显微镜摄像系统，OLYMPUS,日本生产；血细胞分析仪,AITAIKE CA-500,日本制造；离心机，LD4-2型，北京医用离心机厂生产；流式细胞仪(FCM),FACS-420,美国出品。

1.2 方法

1.2.1  免疫性血小板减少性紫癜动物模型的建立  基本的造模方法参照文献^[3，4]加以改进。抗原的制备：取BALB/c小鼠，乙醚麻醉后，以EDTA-Na₂抗凝从心脏取全血，用生理盐水稀释，分离血小板并洗涤。

1.2.2  免疫方法   取以上血小板分别与等量完全福市氏佐剂和不完全福氏佐剂混合制成油包水状抗原，取含完全福氏佐剂抗原0周注射于豚鼠背部皮下至少六点；取含完全福氏佐剂抗原0周分别于2，4，6，8周，注射于豚鼠足掌和背部皮下至少六点，两月后从豚鼠腹主动脉取血，分离血清，制备成豚鼠抗血小板抗血清(APS)，置56°C水浴灭活30分钟，贮存于-20°C冰箱待用。使用前用等量BALB/c小鼠红细胞吸附两次，用生理盐水稀释成不同浓度APS待用。

1.2.3抗血清效价的检测   参照文献介绍ELISA方法^[1]加以改进，以国产冻干酶联A蛋白纯品代替碱性磷酸酶-蛋白A酶标抗体进行检测。

1.2.4  慢性持续ITP动物模型的建立   取小鼠于0,1,3,5,7,9,天分别给予腹腔注射APS,每次100ul(1:6稀释)，造成小鼠慢性持续性ITP模型。

1.2.5  动物分组   实验设正常对照组、豚鼠血清对照组、模型组、阳性药组、低剂量实验组和高剂量实验组共6组，每组10只。

1.2.6  给药方法：实验组和阳性药对照组均从第一次腹腔注射APS 24小时后灌胃给予不同剂量的药物，阳性药物组给予血康胶囊，20ml·kg^-1d^-1,低剂量组给予二号再生胶囊, 1g·kg^-1d^-1, 高剂量组给予二号再生胶囊, 2g·kg^-1d^-1,其它各组给予等量生理盐水。连续给药10天。

1.2.7  观察指标  观察实验中小鼠的精神活动状况、出血情况、皮毛光泽、饮食饮水量、大小便、体重变化及死亡情况。实验结束后（实验第12天），首先检测各组小鼠出血和凝血时间，然后处死小鼠，眼球取血用血细胞分析仪检测血象，用流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群、取脾脏和胸腺称重按照文献介绍方法计算胸腺和脾脏指数^[5]、取脾脏以10%甲醛固定做病理检查，取股骨（右）骨髓涂片，瑞士和Giemsa染色，计数全片的巨核细胞数以及巨核细胞分类计数。

1.2.8  数据统计处理  所有实验参数以SPSS10.0软件包进行统计学处理，数据以χ±s 表示，各组之间比较采用两样本均数间的T检验统计方法。

2.1  一般体征  模型组小鼠出现明显皮下紫癜，以注射部位（腹部）、阴囊、四肢、尾部为重，雄性小鼠出血症状重于雌性小鼠。其余注射APS各组小鼠也有出血症状，但较模型组小鼠明显减轻。处死小鼠解剖后发现模型组小鼠有胃肠道出血点，其余各组未见内脏出血表现。

2.2  体重、胸腺和脾脏指数改变  模型组小组实验结束后，体重稍减轻，但与其它各组相比无显著性差异（P>0.05）。模型组小鼠脾脏显著增大，脾脏指数增高，与其它各组相比均有显著性差异（P<0.01）。给药组小鼠脾脏明显减小，与模型组相比差异显著（P<0.01）。胸腺指数各组间无显著性差异（P>0.05）。见表1。

表1.各组小鼠体重、脾脏指数和胸腺指数的比较（n=10，χ±s）

     *:与模型组相比P>0.05     #:与模型组相比P<0.01

2.3  出凝血时间  模型组小鼠出凝血时间延长，但经统计学检验与其它各组无显著性差异（P>0.05）。见表2。

表2.各组小鼠出血和凝血时间的比较（n=10，χ±s）

        *:与模型组比较P>0.05

2.4  外周血象变化 模型组小鼠血小板明显降低，与其它各组相比均有显著性差异（P<0.01）。给药组小鼠血小板明显增多，与模型组相比有显著性差异(P<0.01),但仍未达到正常组小鼠血小板水平。模型组小鼠红细胞和血红蛋白降低，与实验组相比有统计学差异（P<0.01）。模型组白细胞显著增多，与正常对照组相比有显著性差异（P<0.01），但与各给药组比较无显著性差异(P>0.05)。见表3。

表3.各组小鼠血象的比较（n=10，χ±s）

#:与模型组比较P<0.05; ##:与模型组比较P<0.05; *:与模型组比较P>0.05

2.5  骨髓巨核细胞计数  模型组骨髓巨核细胞数明显增多，与正常对照组相比有显著性差异（P<0.01），经给药治疗后巨核细胞数恢复正常，尤其是产板巨核细胞数显著增多，与模型组相比差异显著(P<0.01)。见表4。

 

表4.各组小鼠骨髓巨核细胞计数的比较（n=10，χ±s）

                     #:与模型组比较P<0.01

2.6  外周血T淋巴细胞亚群  模型组与正常对照组相比，CD8明显增高，CD4/CD8

比值明显降低，CD3和CD4无明显变化。经药物治疗后，巨核细胞数恢复正常，尤其以产板巨核细胞显著增多，与模型组比较有显著性差异（P<0.01）。见表5。

表5.各组小鼠淋巴细胞亚群比较（n=10，χ±s）

                 #:与模型组比较P<0.01

2.7  组织病理学改变  脾脏组织病理学检查表明，模型组脾脏巨核细胞明显增多，脾重增加与巨核细胞增多有明显的一致性。

   特发性血小板减少性紫癜属中医血证之范畴，祖国医学认为“疹为太阴风热，斑为阳明热毒”。阳明主肌肉，阳明气分热盛，热扰血分，迫血妄行，发为肌衄，形成紫斑，此离经之血即是淤血，淤血阻于脉络，反过来又导致血不循经而外溢，使紫斑加重。因此本方剂立足于清热凉血，活血止血，祛淤补虚。本实验结果表明,二号再生胶囊可以减轻ITP小鼠出现的紫癜和胃肠道出血症状，对ITP小鼠有明显的治疗作用，表现为血小板明显增多，骨髓细胞成熟障碍减轻，巨核细胞数恢复正常，尤其以产板巨核细胞显著增多，脾脏指数降低，外周血CD8降低，CD4/CD8比值升高。以高剂量实验组效果作为明显。二号再生胶囊治疗特发性血小板减少性紫癜模型小鼠疗效显著，尤其以升高血小板的作用最为明显。其作用机制与调节机体的免疫功能有关。

1．黄振翘.中医药治疗原发性血小板减少性紫癜的现代药效学设计与方法的研究.中医药通报,2002,1(4):34-38

2．宋善俊，姚军霞.病毒感染与血小板减少性紫癜.中国实用内科杂志，2002,22(3):137-138

3．杨宇飞，周霭祥，麻柔.免疫性血小板减少性紫癜动物模型的建立.中华血液学杂志,1994,15(3):160-161

4．刘宏潇，张雅丽，田维毅，等.特发性血小板减少性紫癜脾不统血证动物模型建立.辽宁中医杂志，2002,29(9):571-572

5．李仪奎，王钦茂，主编.中药药理实验方法学.第1版.上海:上海科学技术出版社,1991.155-156